张新华 周艳洁 罗瑞贵 李平萍 阮丽明 兰小英 黄梦沙 吴志奎 王荣新

【摘要】  目的 调查南宁市农村育龄人群β地中海贫血（地贫）基因携带率，确定四种检测系统诊断β地贫血红蛋白A2（HbA2）截断值。方法 高效液相色谱法（HPLC）检测育龄青年2 044例，其中430例（地贫筛查中随机选择的75对夫妇以及血细胞分析提示夫妇双方或一方为地贫表型阳性的育龄青年280例）同步进行地贫基因分析和3种碱性电泳法（法国Sebia全自动电泳系统（Sebia）、国产Sang Te全自动电泳系统（Sang Te）和pH8.6醋酸纤维膜电泳法（pH8.6））的检测，以基因分析结果为金标准通过受试者工作曲线（ROC曲线）确定HPLC和3种碱性电泳法诊断β地贫的HbA2截断值。结果 在2044例育龄青年中检出β地贫163例，携带率为7.97％，随机选择的75对夫妇地贫基因分析确诊的β地贫为13例，携带率为8.67％。诊断β地贫杂合子的HbA2截断值分别为HPLC≥4.35％、Sebia≥3.65％，Sang Te≥4.58％，pH8.6≥2.66％。结论 南宁农村育龄人群β地贫基因携带率高，HbA2检测结果有人种差异，应重新通过ROC曲线确定截断值，β地贫筛查尽量不使用pH8.6醋酸纤维膜电泳法。
【关键词】β地中海贫血；色谱法，高效液相；ROC曲线

Screening of β-thalassemia  in Nanning people of reproductive age  and ascertaining of cutoff value of HbA2   ZHANG Xin-hua， ZHOU Yan-jie，LUO Rui-gui，LI Ping-ping， RUAN Li-ming，LAN Xiao-ying，HUANG Meng-sha，WU Zhi-kui，WANG Rong-xin . Department of Hematology，The 303 Hospital  of  PLA，Nanning  530021，China
【Abstract】 Objective To  investigate the carrier rate of β-thalassemia  in
Nanning  people  of  reproductive age  and  to ascertain  the cutoff  value of

hemoglobin A2 (HbA2) for diagnosing β-thalassemia  with 4 kinds of detection system. Methods 2044 cases of reproductive age youth were detected with high performance liquid chromatography (HPLC). Among them, 430 cases (75 couples randomly selected in thalassemia screening, 280 cases who are hinted that one or both of the couple were positive for thalassemia phenotype through hemocyte analysis) carry out thalassemia gene detection and 3 kinds of alkalinous electrophoresis (Sebia auto electrophoresis, France, Sebia; Sang Te auto electrophoresis system, Sang Te; Acetic acid fibrous membrane electrophores at pH 8.6, pH8.6) in synchronize. Gene analysis is allocated to be gold standard, and cutoff values of HbA2 for HPLC and 3 kinds of alkalinity electorphoresis methods for diagnosingβ-thalassemia were ascertained  by  Receiver operator characteristic curve (ROC curve).  Resluts 163 cases of β-thalassemia are detected in 2044 cases of reproductive youth, thus carrier rate is 7.97%.  Among the 75 couples randomly selected, 13 cases are diagnosed β-thalassemia with thalassemia gene analysis, and carrier rate is 8.67%. Cutoff value of HbA2 for diagnosingβ-thalassemia is HPLC≥4.35％, Sebia≥3.65％, Sang Te≥4.58％, pH8.6≥2.66％, respectively.  Conclusion β-thalassemia carrier rate is high in Nanning reproductive youth. Detection result of HbA2 is of population variance, and cutoff value should be ascertained by ROC curve. Acetic acid fibrous membrane electrophores should be avoided in β thalassemia screening.
【Keywords】beta-thalassemia; chromatography ,High perssure liquid; ROC curve 

地中海贫血（地贫）是广西发病率最高危害最大的遗传性疾病，已进行的地贫筛查结果显示广西β地贫基因携带率为5.8％~6.78％[1，2]，均为应用碱性电泳法定量检测血红蛋白A2（HbA2）和血红蛋白F(HbF)进行诊断。近年来应用高效液相色谱法（HPLC）检测HbA2 和HbF进行β地贫筛查的价值得到肯定[3]，国际地贫协会推荐使用HPLC进行β地贫筛查[4]。2005年5月至10月南宁市政府牵头组织进行了全市农村育龄夫妇地贫筛查，我们以HPLC检测了2 044例，并选择430例（地贫筛查中随机选择的75对夫妇以及血细胞分析提示夫妇双方或一方（另一方确认为β地贫）为地贫表型阳性的育龄青年280例）同步进行地贫基因分析和另外3种碱性电泳法的检测，以基因分析结果为金标准通过受试者工作曲线（Receiver operator characteristic curve，ROC曲线）确定HPLC和3种碱性电泳法诊断β地贫的HbA2截断值（cutoff value），以提高地贫筛查的准确性，减少漏诊和误诊。

对象和方法

1.对象：广西南宁市邕宁、青秀、江南、良庆4区及所辖横县、武鸣、宾阳、上林和隆安5县农村育龄夫妇2 044例，年龄25岁~46岁，壮族1 654例，汉族378例，瑶族12例，广西籍2 042例，广东籍2例。
2.方法：⑴当地有关机构组织受检育龄夫妇到当地卫生部门，现场抽取静脉血4ml，以EDTA抗凝，置放250C以下室温保存，12h内完成血细胞分析，24h内完成HbF和HbA2检测，地贫基因分析样品置放-20 0C分4批检测。⑵全自动血细胞分析：以美国产Cell Dyn 1700全自动血细胞分析仪进行血细胞分析，平均红细胞体积（MCV）<79fl和/或平均红细胞血红蛋白含量（MCH）<27pg为地贫表型阳性[3]。⑶ HPLC 的HbF和HbA2检测：以美国BIO-RAD公司生产的血红蛋白自动分析仪-VARIANT（β-Thalassamia  Short  Progran）及专用试剂，按操作说明直接用抗凝血加溶血素混合后测定，直接打出检测结果。⑷碱性电泳法的HbF和HbA2检测：①法国Sebia全自动电泳系统（Sebia）、②北京金桑特医用仪器有限公司生产的Sang  Te  SH2020全自动电泳系统（Sang Te）和③pH8.6醋酸纤维膜电泳法（pH8.6），①②使用配套的电泳膜按说明书执行，③采用721分光光度计比色法，按《全国临床检验操作规程》执行。血红蛋白溶液制备采用四氯化碳溶血法。⑸地贫基因分析：3种常见缺失型α地贫基因（-α3.7/，-α4.2/，-αSEA/）分析采用Gap-PCR 技术，我国常见的5种非缺失型α地贫基因（Hb ConstantSprimg、Hb Quong Sze、Hb Westmead、ααCD30、ααCD59）和17种β地贫基因（41-42、71-72、17、-28、βE 、IVS-II-654、IVS-I-1、IVS-I-5、43、31、27/28、-32、-29、30、14-15、CAP、Int）分析采用反向斑点杂交技术，用深圳益生堂生物企业有限公司生产的全血基因组提取试剂盒和基因诊断试剂盒按文献[5，6]和说明书操作。
3.诊断标准 按《血液病诊断及疗效标准》[7]重型和中间型β地贫临床诊断主要根据HbF和Hb来确定，轻型和基因携带者主要根据HbA2来确定。
4.统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对实验数据进行分析，性别间差异进行两样本间t检验。

结    果

1. 430例地贫基因分析结果 未发现常见3种α地贫基因缺失和5种α地贫基因突变及17种β地贫基因突变的健康成人173例，β地贫杂合子69例（4例HbE），α地贫复合β地贫19例，α地贫、小见类型血红蛋白病和其他原因贫血169例。
2. HPLC健康成人HbA2值 173例健康成人HbA2的统计学分析表明HPLC检测数据的频数分布服从正态分布，HbA2 检测值的范围为2.1%~3.7%，平均值为2.85％，标准差为0.29％，95%频数分布范围为2.28%~3.42%，按性别分组后做统计学分析，男女HbA2值分别为(2.87±0.31)%和(2.83±0.28)%，两组间数据方差齐（F=2.928，P=0.089>0.05），无统计学意义（t=0.983，P=0.327>0.05）。
3. HPLC诊断β地贫杂合子HbA2截断值的确定 以基因分析结果为金标准，以238例样本（173例健康成人和65例β地贫杂合子（4例HbE杂合子未纳入统计））HPLC的HbA2 值确定HbA2β地贫诊断截断值，在HbA2诊断β地贫时不同截断值界定范围内产生一系列敏感度和特异度，以1-特异度为横坐标，敏感度为纵坐标，绘制ROC曲线，确定HPLC 诊断β地贫的HbA2截断值为≥4.35％。
4.β地贫检出率 在2 044育龄青年中以HbA2 ≥4.35％为β地贫诊断截断值检出轻型β地贫、静止型β地贫基因携带者和HbE 160例，以HbF增高和Hb下降检出中间型β地贫2例，地贫表型阳性基因分析避免漏诊1例，合计检出163例，南宁育龄人群β地贫基因携带率为7.97％。随机选择的75对夫妇基因分析确诊的β地贫为13例，β地贫基因携带率为8.67％。
5.碱性电泳法诊断β地贫杂合子HbA2截断值的确定  Sebia、Sang Te和pH8.6检测的HbA2数据的频数分布均服从正态分布，按性别分组后做统计学分析，Sebia、Sang Te和pH8.6各自组间数据方差齐（分别为F=0.317，P=0.574>0.05；F=0.004，P=0.948>0.05；F=1.308，P=0.254>0.05），差异均无统计学意义（分别为t=1.442，P=0.151>0.05；t= -0.159，P=0.874>0.05；t= -0.979，P=0.329>0.05）。绘制ROC曲线确定的诊断β地贫杂合子HbA2截断值为：Sebia≥3.65％，Sang Te≥4.58％，pH8.6≥2.66％，四种系统检测结果ROC曲线见图1。

图1:四种检测系统HbA2值的ROC曲线

6.四套系统检测HbA2诊断β地贫的意义 基因分析结果显示按上述ROC曲线确定的诊断β地贫杂合子HbA2截断值判断238样本中173例健康成人误诊例数和65例β地贫杂合子漏诊例数分别为HPLC：0例和1例，Sebia：各1例，Sang Te：2例和4例，pH8.6：32例和4例。

讨    论
 
以HPLC进行的β地贫筛查结果显示，南宁育龄人群β地贫基因携带率高达7.97％（小样本150例的基因分析结果为8.67％），高于广西其它地贫筛查的报道，也高于国内其它地区少数民族β地贫筛查的报道[1，2，8，9]。已报道的国内β地贫筛查均应用碱性电泳法进行[1，2，8，9]，我们采用的是国际地贫协会推荐的HPLC，因此可能与所用检测设备及相应设备确定的HbA2截断值相关。重型和中间型β地贫Hb明显降低，临床症状明显，临床上常通过检测明显增高的HbF明确诊断，而通常只有轻度贫血或没有贫血的β地贫杂合子在筛查中只能通过检测略为增高的HbA2来诊断，因此准确检测HbA2是β地贫筛查的关键。
美国BIO-RAD公司提供的说明书介绍75例美国California健康成人HPLC HbA2范围为1.75%~3.25%，平均值为2.57%，而β地贫杂合子HbA2范围为4%~9%，由此推荐的诊断β地贫杂合子HbA2截断值为≥4％，我们基因分析的β地贫样本中只有漏诊的一例β地贫杂合子HbA2 <4.35％，其它的64例杂合子HbA2范围为5%~9%，173例健康成人HbA2均≤3.7％，ROC曲线确定的南宁β地贫杂合子诊断截断值与BIO-RAD公司推荐的β地贫杂合子诊断截断值有距离，可能与人种有关，也可能与检测例数少有关。法国Sebia公司提供的说明书推荐的诊断β地贫杂合子HbA2截断值为>3.5％，与我们确定的截断值也有所不同， Sang Te诊断β地贫杂合子HbA2截断值与公司推荐的也有差距，然而差距最大的是pH8.6，国内仍有较多的医院使用pH8.6检测HbA2诊断β地贫，所取的诊断截断值相差较大（>3.5%~>4.2％）[8，9]，此次我们以较大样本地贫基因分析结果为金标准经ROC曲线确定的截断值（≥2.66％）与文献报道采用的截断值有较大差距，方建培报道62例β地贫杂合子HbA2检测值范围是2.2%~6.9％[10]，与我们检测的结果相近。本组资料结果显示若以≥2.66％为截断值，173例健康成人会有32例误诊，65例β地贫杂合子会有4例漏诊，而以通常采用的>3.5%为截断值则分别是4例误诊和32例漏诊，漏诊率太大，由于pH8.6检测操作流程复杂，人为因素影响较多，大批量样本的检测更容易造成漏诊误诊，应由HPLC或全自动电泳系统取代。

参考文献

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3Joutovsky A，Hadzi-Nesic J，Nardi MA. HPLC  retention  time  as  a  diagnostic tool for hemoglobin variants and hemogobinopathies:a study of 60000 samples in a clinical diagnostic laboratory.Clin  Chem，2004，50：1736-1747
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致谢：
参加工作的还有南宁市计划生育服务中心的魏萍、任晓玲、郑爱卿，解放军303医院血液科的周天红、尹晓林、曾丽红、王丽、林俊、韦炅、张天朗、黄慧婷、李静。工作中得到南宁市人口与计生委的黄海主任和黄松龄副主任的大力支持与帮助，还得到Professor  Dr. Elizabeth George Unit Head of Hematology，Department of Clinical Laboratory Sciences， Medical Faculty and Health Sciences，Universiti Putra Malaysia的指导，在此一并致谢。

(来源：中华检验医学杂志，2007年第一期）)
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（90409003）和广西自然科学基金资助项目（桂科自0447104）作者单位：530021，南宁，解放军303医院血液病科（张新华、罗瑞贵、李平萍、兰小英、黄梦沙、王荣新）；南宁市计划生育服务中心（周艳洁、阮丽明）；中国中医科学院广安门医院分子生物学研究室(吴志奎)